Somatisk embryogenes

Delprojekt 1. Reglering av mognadsprocessen av somatiska embryon.

Embryogena kulturer av gran tillväxer i form av proembryogena cellaggregat s.k. PEM (proembryogenic masses). Tillväxten går snabbt. För att stimulera plantframställning måste tillväxten av PEM stoppas och utvecklingen av somatiska embryon från PEM stimuleras. Detta sker genom att cellkulturerna överförs till ett odlingsmedium som saknar tillväxtregulatorer. Denna behandling inducerar programmerad celldöd, vilket är viktigt för framställning av ett stort antal mogna somatiska embryon av hög kvalité.

Programmerad celldöd induceras i embryogena kulturer i samband med att tillväxthormoner, och speciellt auxin, avlägsnas. Vi har identifierat signalmolekyler vilka kan ersätta auxin när det gäller att hämma programmerad celldöd. Av särskilt intresse är en lipochitooligosackaridmolekyl (Dyachok et al. 2002).

Vi har även studerat hur extrecellulärt pH ändras i samband med att somatiska embryon utvecklas från PEM och funnit att pH sjunker i samband med att cellerna genomgår programmerad celldöd. Vid konstant pH (buffrat odlingsmedium) förhindras programmerad celldöd och även utvecklingen av somatiska embryon (Bozhkov et al. 2001).

Vi har isolerat en gen från gran vilken reglerar bildandet av ett enzym (ett metacaspas) som stimulerad programmerad celldöd. När enzymet inhiberas reduceras antalet celler i PEM som genomgår programmerad celldöd och embryoutvecklingen blockeras helt eller delvis. Resultaten från detta arbete har sammanställts i en uppsats som har accepterats för publicering (Bozhkov et al. 2004). Vi har även visat att enzymet inaktiveras i närvaro av zink. Då zink finns i odlingsmediet undersöker vi nu närmare hur zink påverkar programmerad celldöd och utveckling av somatiska embryon. En viktig del i detta projekt är att lokalisera zink i cellerna och korrelera den cellulära koncentrationen av zink med programmerad celldöd.

Delprojekt 2. Kunskap om hur olika faktorer under mognadsfasen påverkar den senare planttillväxten och den genetiska stabiliteten.

Den metod som används för att framställa somatiska embryon påverkar embryonas kvalité och utveckling till plantor. Vi har undersökt hur två olika metoder påverkar embryoutvecklingen och den senare tillväxten av plantorna. Den ena metoden inkluderar att många celler i PEM genomgår programmerad celldöd i samband med bildandet av somatiska embryon, medan den andra metoden inducerar programmerad celldöd i endast några få celler i PEM. Vi har funnit att antalet embryon som utvecklas då många celler genomgår programmerad celldöd är fem gånger högre jämfört med då programmerad celldöd endast inträffar i några få celler. Även om antalet plantor som bildas vid låg grad av programmerad celldöd är lägre så påverkas inte plantornas tillväxt när de har planterats i växthus.

Vi har även analyserat den genetiska stabiliteten i embryogena kulturerna i samband med utvecklingen av somatiska embryon. Den genetiska stabiliteten undersöktes i tre mikrosatellit-loci (SSR). Samma mikrosatelliter har tidigare utnyttjats för att påvisa genetisk instabilitet i en embryogen cellinje från gran. Totalt analyserade vi 515 alleler i 104 prover. Vi fann inga genetiska förändringar i något prov.

Delprojekt 3. Urvalseffekter, inomklonvariation, sticklingförökning fältförsök.

Urvalseffekter och inomklonvariation Resultat från studier av planttillväxten under de första två tillväxtperioderna och variation inom kloner har publicerats i Tree Physiology. Resultaten visar att plantor framställda med somatisk embryogenes var i genomsnitt mindre än fröplantor i starten men höll sedan minst samma fart. I relativa tal växte embryoplantorna bättre än fröplantorna.

Inomklonvariationen var stor efter acklimatisering och odling av samtliga somatiska embryoplantor som utvecklat rötter och skott under groningen. Om ett urval av endast stora plantor och plantor som utvecklat sidorötter förbättrades klonernas tillväxt och inomklonvariationen minskade.

Tidigare studier av urvalseffekter och effekter av behandlingar  kombinerades med ovanstående resultat samt resultat från urvalsstudier med sticklingar i en doktorsavhandling av Karl-Anders Högberg. I den fastslogs att potentialen i metoden är stor, att mognad är ett avgörande -steg och att snabb tillväxt efter acklimatisering är viktigt för att nå jämna och bra växande kloner.

Sticklingar från somatiska embryoplantor Moderplantor av olika planttyper odlades upp på Ekebo. Planttyperna var: somatiska embryoplantor, sticklingplantor och fröplantor. Moderplantorna delades upp i två delar varav den ena flyttades till Odlarnas plantskola i Falkenberg och den andra stannade kvar i plantskolan i Ekebo. I Ekebo klipptes sticklingar i början av augusti 2002, medan sticklingarna hos Odlarna klipptes ca 3 veckor senare. I båda fallen sattes sticklingarna för rotning omedelbart.

Rotningsprocenten blev måttlig, högst i Falkenberg, men skillnaderna mellan moderplanttyperna var små. En av orsakerna till den högre rotningsprocenten i Falkenberg kan vara den senare stickningen, som betydde att sticklingarna var fysiologiskt bättre redo för rotning. Slutsatsen blir att det torde inte vara några problem att rota sticklingar från somatiska moderplantor.

Fältförsök Totalt finns nu demonstrationsförsök med somatiska embryoplantor på fem lokaler: Rölunda, Ekebo och Brunsberg på åkermark, Salungen och Berga på skogsmark. Ett äldre försök på Rölunda har drabbats av så mycket skador att det lagts ner.

För alla fältförsöken gäller att fröplantor och somatiska plantor växer på samma sätt. Före en del kloner var medelhöjden i utgångsläget mindre än fröplantor och i några fall kvarstår en skillnad, men trenden är att skillnaderna utjämnas.

Delprojekt 4. Klonskogsbruk med somatisk embryogenes.

Plantproduktion Under projekttiden har plantor producerats från två initieringar, 2000 respektive 2002. Den första initieringen gjordes i juli/augusti 2000 och omfattade 253 zygotiska embryon från 13 familjer (7 helsyskon och 5 halvsyskonfamiljer). Dessutom togs 26 embryon från kottar som skördats i plantage 96 Skogsgård utan kontroll på moderklon. Av dessa kunde 96 embryogena cellinjer etableras och gå in i prolifering för att sedan kryopreserveras. På grund av ett stort åtagande i ett EU-projekt rörande somatisk embryogenes med tall blev kryopreserveringen försenad och kunde starta först våren och försommaren 2001, d v s nästan ett år efter initieringen. Med stor sannolikhet på grund av detta blev utfallet av kryopreserveringen sämre än förväntat. Endast 16% av cellinjerna svarade med återupptagen proliferering efter tining som gjordes under perioden november 2001 – juni 2002. Under 2002 gick sex av cellinjerna vidare till mognad, följt av partiell torkning och därefter groning. Acklimatisering av 588 plantor skedde i mars respektive maj 2003 och i januari 2004 uppgick plantantalet till 534 st. Som kontroll användes 56 fröplantor från familj 25.

Intressant är att notera att ett urval av de högsta 20 plantorna per klon, ungefär motsvarande plantantalet som behövs för klontestning i fält, gav en markant ökning av klonmedelvärdet i höjd. För tre av klonerna blev medelvärdet lika eller högre än fröplantorna, medan tre av klonerna presterade sämre än fröplantkontrollen. Variationskoefficienten var avhängig hur starkt urval som var möjligt och klonens nivå före urval. Båda acklimatiseringsomgångarna ingår i beräkningarna.

Den andra förökningsomgången inleddes med initiering i juli/augusti 2002. Förökningen startade med att 354 zygotiska embryon lades på initiering, representerande 10 familjer. Av 354 zygotiska embryon reagerade 274 på initieringen (77 %). Totalt etablerades 128 nya cellinjer från  förädlingspopulationen av gran. Efter anpassning till projektets kapacitet, reducerades antalet cellinjer till 64 st. från 10 familjer. Cellinjerna kryopreserverades så fort som möjligt efter initieringen, d v s i december 2002 och i början av 2003.

Av dessa 64 cellinjer från 10 familjer svarade totalt 44 cellinjer från 7 familjer med proliferering efter tining. Frekvensen cellinjer som kunde förökas efter kryolagring blev sålunda 69 % att jämföra med 16 % i 2002. Detta resultat visar att kryolagringen av cellinjerna som initierades 2002 har fungerat bra och mycket bättre än kryolagringen av de som initierades 2000. Orsaken till detta är med stor sannolikhet att de nya cellkulturerna kryolagrades så fort som möjligt efter initieringen. Dessutom visar de första resultaten att en ny behandling före kryolagring som testades 2003 påverkar tillväxt efter tining positivt (högre antal cellinjer som prolifererar efter tining samt tidig respons och tillväxt av embryogena vävnadskulturer efter tining). Behandlingen går till så att kulturerna förvaras i kyl (4 grader C) i en vecka före nedfrysning.

För detta material har, under sommaren 2003, 40 cellinjer från 6 familjer genomgått mognad så fort som möjligt efter tining och proliferering. Mognadsprocessen fungerade mycket bra och frekvensen cellinjer som producerade mogna somatiska embryon uppgick till 80 % (32 cellinjer från 6 familjer).

Totalt 6689 mogna somatiska embryon (16 – 257 per cellinje) erhölls efter 5 – 8 veckor på medium med abskissinsyra (ABA), och genomgick partiell torkning i enlighet med vårt standardprotokoll. I slutet av 2003 0ch början av 2004 acklimatiserades 2590 somatiska plantor (39 %).

Partiell torkning är ett tidskrävande och därmed kostsamt steg i standardprotokollet. Därför testades en alternativ behandling: efter 8 veckor på mognadsmedium (med ABA), sattes 5410 mogna somatiska embryon i 4 grader C under 3 veckor (kylbehandling). Efter groning på fast medium följt av fortsatt utveckling med rötterna i flytande medium (enligt standardprotokollet), acklimatiserades totalt 728 somatiska plantor (13,5 %) framställda utan partiell torkning av embryona. Andelen somatiska embyoplantor som kunde acklimatiseras i växthus blev högre efter partiell torning jämfört med kylbehandling. Detta är troligen en konsekvens av att behandlingen med ABA blev längre för kylbehandlade embryon: 5 till 8 veckor vid partiell torkning mot 11 veckor vid kylbehandling. Resultatet av experimentet med kylbehandling visar att det är fullt möjligt att producera plantor utan partiell torkning av de somatiska embryona. Genom att förkorta tiden på mognadsmedium (ABA verkar inhiberande på groning) kommer troligen att öka frekvensen plantor med god prognos för lyckad acklimatisering.