Kontroll av genetisk stabilitet hos kryolagrad embryogen vävnad

Bakgrund

Somatisk embryogenes är en vegetativ förökningsmetod där somatiska embryon bildas från sterila cellkulturer initierade från fröembryon. Fördelen med somatisk embryogenes jämfört med andra vegetativa förökningsmetoder är att embryogen vävnad kan i långa tider förvaras i mycket låga temperaturer, s.k. kryolagring, under tiden som samma genotyper testas i fält. En viktig förutsättning för att somatisk embryogenes skall uppfylla kraven för en vegetativ förökningsmetod, är att genotyper bevaras genetiskt oförändrade. Målet med denna studie är att med DNA-markörer bestämma huruvida kryolagring förorsakar genetiska förändringar i embryogen vävnad av gran och dessutom ge en bild över hur väl anpassad kryolagringsmetoden är.

Material och metoder

Av totalt 10 helsyskonfamiljer tillhörande det ordinarie granförädlingsprogrammet initierades 128 cellinjer. Av de välväxande cellinjerna valdes 16 cellinjer från 9 familjer slupmässigt. Det dubbla antalet cellinjer jämfört med planerade förklaras med behovet av en säkerhetsmarginal under tiningsfasen efter kryolagringen. Så snart det fanns tillräckligt med prolifererad vävnad av de valda kulturerna (2002) insamlades studiens kontrollprov (prov 1) med tre upprepningar av varje cellinje. För att jämföra morfologin mellan olika cellinjer och prover togs även bilder på samtliga 16 cellinjer. Två månader senare, strax före kryopreserveringen insamlades studiens prolifereringsprov (prov 2). Ett år senare (februari 2004) togs samtliga 16 cellinjer upp ur kryolagringen för initiering. Trots upprepade försök med vissa cellinjer reagerade endast 7 cellinjer på initieringen. I mars 2004 samlades studiens tredje vävnadsprov (Prov III) av dessa 7 cellinjer. Rov I representerar studiens kontrollprov, prov II prolifereringsfasen och prov III proliferering efter kryolagring. Samtidigt togs prover för morfologiska studier mellan olika cellinjer. DNA isolerades från samtliga prov (prov I – III) med 3 upprepningar (IA, IB, IC, IIA osv./prov) med så kallad CTAB-metod. Frö undersökandet av genetisk stabilitet användes PCR-RAPD-teknik (Random Amplified Polymorphic DNA). 25 olika slumpmässiga primers testades med s.k. bulk-DNA. Bulk-DNA:t bestod av en mix från alla 7 cellinjer. Fyra primers (primers 3, 4, 7 och 9) var 10 baspar långa medan en (primer 919) var 12 baspar lång.

Resultat

Av sju cellinjer lyckades PCR-RAPD körningen för 6 st. Ingen cellinje hade variationer i samtliga tre upprepningar (kontrollprov IA – IC, proliferering IIA – IIC, proliferering efter kryo IIIA – IIIC) per prov, vilket tyder överlag på en god genetisk stabilitet. Inom två cellinjer (cellinje 02:40:21 och 02:38:19) uppförökades eller fattas RAPD-markörer i enstaka upprepningar. I cellinje 02:38:19 uppförökades med primer 4 en markör på 500bp i upprepning IA och i upprepning IIIB. I cellinje 02:40:21 fattas med primer 7 två markörer på 1250bp och på 650 bp i cellinje IA. Hos samma cellinje uppförökades med primer 3 en markör på 950BP i upprepning IC och i IIA. Dessa variationer mellan cellupprepningarna kan tyda på att enstaka genetiska förändringar uppstår vid vegetativ förökning genom somatisk embryogenes. Man skall inte generalisera resultaten från sådan här liten studie, men enstaka markörer i upprepningarna kan tyda på att instabilitet i cellinjer som vaknat efter kryolagringen.