Metod för storskalig produktion av somatiska embryogenesplantor – Del 1 Systemanalys

Med klonskogsbruk baserat på somatisk embryogenes kan träd med den allra bästa genetiken förökas vegetativt i stor skala vilket ger förutsättningar för kraftigt ökad virkesproduktion. För att denna potential skall kunna realiseras krävs två saker:

• Fälttester för att bestämma vilka kloner som skall förökas.
• Storskalig teknik för att kunna föröka utvalda kloner.

Klontester kan utföras av Skogforsk som uppdrag och startas idag. Detta är resultatet av ett utvecklingsarbete som skett vid Skogforsk sedan 1997. Det finn idag en fungerande, robust metod, lämplig för produktion av somatiska embryogenes plantor till ett klontestprojekt. Klontestningen syftar till ett skarpt urval av kloner för användning i stor skala i ett klonskogsbruk.

För att nå en storskalig användning av somatisk embryogenes krävs en teknisk utveckling/anpassning av förökningsmetodiken. Detta arbete bör bedrivas i samarbete med något av de internationella företag som kommit längst i denna utveckling. Skogforsk kan vara drivande och sammanhållande i en sådan FoU-verksamhet som till stor del bör kunna finansieras via fondmedel.

Av effektivitetsskäl bör arbetet med klontester bedrivas parallellt och samtidigt med utveckling/anpassning av teknik för storskalig förökning.

De i dagsläget mest realistiska samarbetspartnerna i ett utvecklingsarbete för storskalig förökningsteknik är två företag i Nordamerika, Weyerhaeuser i USA och Cellfor i Kanada. Dessa företag har utvecklat två olika tekniska koncept som skiljer sig från varandra i hanteringen av de mogna somatiska embryona. Weyerhaeuser tillverkar artificiella frön genom att kapsla in embryot i ett artificiellt fröskal, medan Cellfor tillämpar direkt plantering av groddplantor från embryon. Beroende på vilket alternativ som väljs kommer strukturen för svensk somatisk embryogenes att se olika ut:

• Med Weyerhaeuser-konceptet licensieras tekniken och en anläggning byggs upp för produktion av artificiella frön i Sverige. Från denna anläggning transporteras fröna till plantskolorna för maskinell sådd och vidareodling enligt normala rutiner. Förutom en ”inträdesavgift” för att få tillgång till tekniken kommer en royaltyavgift att tas ut per planta.
• Med Cellfor-konceptet kommer somatiska embryon att produceras i Kanada, där de torkas och transporteras till Sverige. Embryona planteras därefter i miniodlingshållare för en tidig odling i kontrollerad miljö med hög luftfuktighet. I plantskolan omskolas plantorna maskinellt till större behållare och odlas enligt normala rutiner. Kostnader/avgifter för embryon baseras i förhandling på en uppskattning av mervärdet vid användning av plantorna i skogsproduktion.

Kommersiell användning av somatisk embryogenes kan realiseras när resultaten från klontester fallit ut och den storskaliga förökningstekniken är anpassad till svenska förhållanden. Detta bör kunna ske om ca 10 år. I detta skede bör en organisation bestående av svenska intressenter (t.ex. ett samägt bolag) etableras för att driva den operativa verksamheten. Även denna får olika karaktär beroende på vilket tekniskt/affärsmässigt alternativ som väljs.

Kostnaderna för att få somatisk embryogenes i praktisk användning i svenskt skogsbruk är svåra att uppskatta. Ett försök till sammanställning görs dock nedan.

Sammanställning av uppskattade kostnader för alternativ Weyerhaeuser och alternativ Cellfor.

Weyerhaeuser               Cellfor

F a s t a  i n v e s t e r i n g s k o s t n a d e r Tekniklicens                             Förhandlingsfråga              –

Anläggning för produktion av      3 000 000 kr                     – somatiska embryon, inkl. kryopreservering

Anläggning för produktion          7 000 000 kr                     – av artificiella frön

Anläggning för automatisk              –                             Ej uppskattad plantering och förodling av embryon

R ö r l i g a  k o s t n a d e r Produktionskostnad, per             0,25 kr                        Förhandlingsfråga moget embryo

Produktionskostnad, per             0,10 kr                           – artificiellt frö

Sådd/plantering, per                   0,10 kr                        0,40 kr embryo

Omskolning av ”micro”-                 –                              0,20 kr plantor, per planta

Royalty, per planta                   Förhandlingsfråga              –

Resultat 2010

Totalt 886 zygotiska embryon från de mogna fröna lades på initieringsmedium, motsvarande i genomsnitt 29,5 embryon per familj. Lägsta antal embryon per familj var 24. Motsvarande siffror för de omogna fröna var 1003 embryon, motsvarande i genomsnitt 77,2 embryon per familj. Fördelningen av embryon på familjer blev här betydligt ojämnare, med som lägst 10 och som högst 190. För fyra familjer ur gruppen med embryon från mogna frön erhölls ingen initieringsrespons. För resterande 26 familjer var responsen mycket ojämn och medeltalet av familjernas respons blev 29,6 %. Utan hänsyn tagen till fördelningen på familjer och med samtliga familjer inräknade blev responsen 25,7 %. För embryon tagna från omogna frön blev responsen per familj jämnare. Medelfamiljens respons blev 81,0 % . Utan hänsyn tagen till fördelningen av embryon på familjer blev responsen 78,7 %. Mönstret går igen för prolifereringsresponsen, men nu på en lägre nivå. Ytterligare en familj från gruppen med embryon tagna från mogna frön förlorades i prolifereringsfasen. För de resterande 25 familjerna blev medelresponsen 22,1 %. Utan hänsyn till fördelning på familjer och med alla familjer inräknade blev responsen 18,5 %. Motsvarande siffror för embryon tagna från omogna frön var 45,3 % totalrespons och 51,7 % beräknat som medeltal av familjeresponserna. Skillnaderna mellan gruppen som initierats med embryon från mogna frön och gruppen som initierats med embryon från omogna frön var starkt signifikant (p<0.001) både vad gäller initieringsrespons och prolifereringsrespons. Urvalet av familjer från frölagret gjordes inte med avsikt att analysera lagringstidens betydelse. Eftersom spridningen i lagringstid ändå var ganska stor, från 1 år till 18 år i lager, har denna faktor studerats närmare. Responsen både vad gäller initiering och proliferering sjönk markant vid 4 års ålder eller äldre. Om familjerna fördelades på två grupper, 1-2 år i lager respektive 4 år eller mer i lager, och analyserades med grupp som fix effekt skattades initieringsresponsen till 58,8 % för gruppen med kort lagringstid och 11,8 % för gruppen med lång lagringstid. Motsvarande siffror för proliferering blev 39,7 % och 7,5 %. Båda skillnaderna signifikanta (p<0.001).

Diskussion

Det står helt klart att initieringsresponsen minskar då man använder embryon från mogna, lagrade frön vid initieringen. Bortfall av familjer noterades endast för gruppen mogna frön, 4 av 30 reagerade inte på initieringen och ytterligare en familj föll bort i prolifereringsfasen. För initiering blev skillnaden mellan grupperna räknat i familjemedelvärden ganska stor, ca 30 % med mogna frön och ca 80 % med omogna frön. Det betyder att man för att få samma utfall behöver öka antalet utgångsembryon från mogna frön med en faktor 2,7. Skillnaden mellan de två typerna av utgångsembryon blev lägre i prolifereringsfasen, drygt 20 % mot drygt 50 %, motsvarande en faktor 2,5. Räknat på familjemedelvärden blev den procentuella minskningen från initiering till proliferering något större för cellinjer från omogna frön. En tolkning av detta resultat är att initieringen är flaskhalsen för ”mogna” embryon” och att när väl respons erhållits går nästa steg på samma sätt som med ”omogna” embryon. Det kan inte helt bortses från att genetiken har spelat viss roll för resultaten, särskilt kan det gälla familjerna med embryon från omogna frön som bara var 13 till antalet. Men storleksordningen bör ändå vara pålitlig och alltså ligga någonstans på en faktor 2-3 fram till proliferering. En tendens mot att responsen avtar med tiden i frölager kunde konstateras, såväl vid initiering som vid proliferering. Materialet var inte avsett att testa just detta och resultatet får tas med viss reservation. Det är emellertid inte ologiskt att fröets vitalitet avtar och därmed förmågan att svara på initieringsbehandlingen. Materialet är realistiskt som ett typfall vid en förökning till ett familjeskogsbruk. Under förutsättning att kommande moment i förökningen ger samma resultat som i tidigare förökningar skulle ytterligare två tredjedelar av cellinjerna falla bort. För att då nå upp till 100 plantproducerande cellinjer med mogna frön som utgångsmaterial skulle det teoretiskt krävas totalt 1600 frön till initiering. Det finns dock en faktor till att ta med i beräkningen: förmågan att regenerera många plantor per mängd prolifererande vävnad. Detta är en rent ekonomisk aspekt men kommer att spela stor roll i praktisk förökning. Här finns begränsade data att luta sig mot och de saknas helt för en verkligt storskalig förökning. I den hittills största praktiska förökningen med somatisk embryogenes av gran i Sverige var andelen högproducerande cellinjer (högproducerande med avseende på plantbildningsförmåga) ca 25 % av de som kommit fram till en lyckad plantregenerering. Det betyder i sin tur att av 100 plantproducerande cellinjer kan 25 förväntas fungera i en storskalig förökning. Detta antal cellinjer (eller kloner) är också det riktmärke som angetts för en säker tillämpning av familjeskogsbruk. Med lite extra gardering blir rekommendationen att starta en förökning med 2000 mogna frön, från 30 familjer eller fler, för att nå upp till en ”familjeskogsbruksförökning”. För att kunna ge ännu bättre underlag hade en fortsatt förökning och uppföljning av responsen i kommande moment, dvs. mognad, groning, acklimatisering och tidig tillväxt, varit värdefull. Ovanstående räkneexempel bygger på att mogna cellinjer reagerar på samma sätt som omogna i dessa moment.